8 Erros comuns na análise de dados de expressão gênica obtidos por PCR em tempo real (qPCR)

Os dados produzidos por experimentos com PCR convencional são em sua maioria qualitativos, no máximo, semi-quantitativos. Por outro lado, com o advento da PCR em tempo real e seus dados quantitativos, novos desafios sobre como analisar esses dados surgiram. O que antes era relatado como banda visível ou invisível, ou seja, amplificação e não amplificação, perdeu lugar para expressão relativa, valor indeterminado, amplificação no Ct X com threshold em 0.02, entre várias outras possibilidades.

Em se tratando de qPCR para quantificação da expressão gênica, onde métodos ainda mais elaborados são necessários, alguns erros comumente são cometidos. Com isso, devemos ser cautelosos com a forma com que os dados gerados por essa técnica são analisados, uma vez que algumas particularidades podem fazer grande diferença nos resultados obtidos. Neste post irei falar de alguns erros comuns que tenho visto quando se tratando da análise e apresentação dos dados de qPCR, especialmente para estudos de expressão gênica. Ao mesmo tempo, tento sugerir referências que possam auxiliar nesse processo. Se você tem alguma dúvida, fique a vontade para perguntar.

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How to cite the GTEx project

Great comment from Lior Patcher on the GTEx project! A must read if you work with transcriptomics and tissue-sh gene expression.

Bits of DNA

The GTEx consortium has just published a collection of papers in a special issue of Nature that together provide an unprecedented view of the human transcriptome across dozens of tissues. The work is based on a large-scale RNA-Seq experiment of postmortem tissue from hundreds of human donors, illustrated in Figure 1 of the overview by Ward and Gilad 2017:

550190a-f1

The data provide a powerful new opportunity for several analyses, highlighted (at least for me) by the discovery of 673 trans-eQTLs at 10% genome-wide FDR. Undoubtedly more discoveries will be published when the sequencing data, available via dbGAP, is analyzed in future studies. As a result, the GTEx project is likely to garner many citations, both for specific results, but also drive-by-citations that highlight the scope and innovation of the project. Hopefully, these citations will include the key GTEx paper:

Carithers, Latarsha J, Ardlie, Kristin, Barcus, Mary, Branton…

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Your Biomarker doesn’t work (and a case for reproducible research)!

Sequencing QC and data analysis blog

We have all hear about those “breakthrough biomarkers” that.. simply.. do not work!
There have been numerous reports in the literature that investigate why certain biomarkers don’t work after all.
But before discussing the reasons for failed biomarkers, let me give some examples of disease biomarkers that have been successfully used for diagnosis, prognosis or monitoring. For example:

  • The diagnosis of diabetes is based on the level of glucose in serum after 12 hours of fasting
  • Rubidium chloride is used in isotopic labeling to evaluate perfusion of heart muscle
  • The level of serum creatinine is a great indicator of renal function.
  • cholesterol values are a biomarker and risk indicator for coronary and vascular disease
  •  C-reactive protein (CRP) is a marker for inflammation.

A paper from (Eleftherios P. Diamandis (2010)) shows a few examples of “highly publicized biomarkers” that were never possible to validate. Among the many reasons for…

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Como o Sci-Hub funciona

Olá,

Aproveitando a repercursão que o SciHub tem criado, somado aos equívocos quanto ao seu funcionamento, decidi escrever brevemente sobre isso. Assim, espero conseguir esclarecer um pouco de como o Sci-Hub funciona, técnicamente falando. Por fim, esclareço que as informações aqui descritas são uma simplflicação da descrição de Alexandra Elbakyan, a fundadora do projeto.

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O que é o p-valor? (P-value)

Antes de começar, saliento que mais importante do que saber o que é o P-valor, é saber o que ele não é! Aliás, muitos pesquisadores das ciências biológicas/biomédicas acreditam que ele tem mais importância do que, de fato, tem. Portanto, abaixo deixo minhas reflexões à respeito da estatística mais calculada em toda a ciência e o porque devemos ser cautelosos com sua interpretação.

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Cálculo da Eficiência de qPCR com LinRegPCR

Olá,

Recentemente gravei um vídeo ensinando como utilizar o software LinRegPCR para calcular a eficiência das reações de qPCR. Para quem trabalha com expressão gênica, um dos métodos de quantificação é a expressão relativa, a qual frequentemente é calculada pelo método de Livak e Schmittgen (2001) com a fómula 2^{ -\Delta\Delta Ct}. Todavia, para seu uso adequado, os seguinte pressupostos devem ser satisfeitos:

  1. As eficiências de amplificação do gene-alvo e do gene-de-referência (equivocadamente chamado de Housekeeping ou normalizador) devem ser aproximadamente iguais;
  2. Embora não descrito, o valor 2 na fórmula implica que essa eficiência é de 100%, o que não se observa frequentemente na prática.

Assim, a menos que se realize um ensaio de validação em todas as amostras, primers, equipamentos e reagentes, o método acima não é o mais indicado. Diante disso, Pfaffl (2001) propôs um modelo matemático que incorpora a eficiência dos primers de qPCR. Consequentemente, no vídeo abaixo eu demonstro a obtenção dessas eficiências para utilização nas equações de Pfaffl (2001).

Abaixo o vídeo tutorial.

Qualquer dúvida, por favor, deixe um comentário.

 

Referências

  1. Livak, K. J. e Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, 25, 402-408, 2001.
  2. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res., 29, 2001.
  3. Ruijter, J. M. et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res., 37, 2009.
  4. Pfaffl et al. Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res., v. 30, n. 2, 2009.

Como instalar R x64 | Rstudio no Ubuntu 17.04

Apenas um post rápido para quem está tendo alguma dificuldade para instalar o R x64 e/ou RStudio no Ubuntu. Antes de executar, é um bom hábito ler o código.


sudo apt-get update

## Veja sua versão
lsb_release -a

## Execute o código abaixo de acordo com a versão obtida pelo código acima:

# Ubuntu Zesty
sudo echo "deb https://cloud.r-project.org/bin/linux/ubuntu zesty/" | sudo tee -a /etc/apt/sources.list

# Ubuntu yakkety
sudo echo "deb https://cloud.r-project.org/bin/linux/ubuntu yakkety/" | sudo tee -a /etc/apt/sources.list

# Ubuntu xenial
sudo echo "deb https://cloud.r-project.org/bin/linux/ubuntu xenial/" | sudo tee -a /etc/apt/sources.list

# Ubuntu trusty
sudo echo "deb https://cloud.r-project.org/bin/linux/ubuntu trusty/" | sudo tee -a /etc/apt/sources.list

# Ubuntu precise
sudo echo "deb https://cloud.r-project.org/bin/linux/ubuntu precise/" | sudo tee -a /etc/apt/sources.list

## Para instalar o R e alguns de seus pacotes é necessário também:

deb https://cloud.r-project.org trusty-backports main restricted universe

## Instale o R base

sudo apt-get update
sudo apt-get install r-base r-base-dev

## Para o RStudio funcionar adequadamente, alguns pré-requisitos devem ser satisfeitos:

cd Desktop

wget "http://ftp.br.debian.org/debian/pool/main/g/gstreamer0.10/libgstreamer0.10-0_0.10.36-1.5_amd64.deb" "http://ftp.us.debian.org/debian/pool/main/g/gst-plugins-base0.10/libgstreamer-plugins-base0.10-0_0.10.36-2_amd64.deb"
wget "http://mirrors.kernel.org/ubuntu/pool/universe/libj/libjpeg6b/libjpeg62_6b2-2_amd64.deb"

sudo dpkg -i libjpeg62_6b2-2_amd64.deb
sudo dpkg -i libgstreamer0.10-0_0.10.36-1.5_amd64.deb
sudo dpkg -i libgstreamer-plugins-base0.10-0_0.10.36-2_amd64.deb

wget "https://download1.rstudio.org/rstudio-1.0.143-amd64.deb"

sudo dpkg -i rstudio-1.0.143-amd64.deb

rm libgstreamer-plugins-base0.10-0_0.10.36-2_amd64.deb
rm libgstreamer0.10-0_0.10.36-1.5_amd64.deb
rm libjpeg62_6b2-2_amd64.deb

Qualquer dúvida, por favor, deixe um comentário.
Espero ter ajudado.

Personal R Packages

I couldn’t agree more! Fica a dica! Pacotes pessoais no R.

Not So Standard Deviations

I came across this R package on GitHub, and it made me so excited that I decided to write a post about it. It’s a compilation by Karl Broman of various R functions that he’s found helpful to write throughout the years.

Wouldn’t it be great if incoming graduate students in Biostatistics/Statistics were taught to create a personal repository of functions like this? Not only is it a great way to learn how to write an R package, but it also encourages good coding techniques for newer students (since it encourages them to write separate functions with documentation). It also allows for easy reprodicibility and collaboration both within the school and with the broader community. Case in point — I wanted to use one of Karl’s functions (which I found via his blog… which I found via Twitter), and all I had to do was run:

(Note that install_github…

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Well, that will cause some eye-rolling: All biology is computational biology!

Worth reading

Scientific B-sides

I met Emma Ganley from PLOS Biology at the #scidata16 conference last year, and shortly afterwards she invited me to contribute to the PLOS Biology collection Research Matters:

In this series, we ask leading scientists in their respective fields to explain clearly and engagingly for a lay audience why the research carried out in their laboratories – and those of their collaborators and their colleagues – matters.

It wasn’t immediately clear to me, what I should write about. I tend to label myself a cancer researcher nowadays, but cancer research does not need any explanation why it matters – unfortunate as that is.

At the same time, I am a computational biologist – and here I thought was a much bigger need to explain why it matters. The question is not so much why computational biology and bioinformatics are useful (nobody seems to question that it’s handy to have…

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Predição curva de dissociação com uMelt | Melting curve analysis

Vídeo

Olá,

Para marcar meu retorno às atividades na rede, posto um vídeo em que ensino como prever a curva de dissociação de um produto de qPCR. Com isso, você pode saber se o que você obteve é realmente o esperado, ou se seu primer amplificou algo indesejado etc.

Sobre a parte teórica necessária para interpretar resultados de qPCR e realizar otimizações, etc., eu acredito que já existe bastante material (textual e audiovisual) na web. Portanto, caso tenham alguma dúvida é só comentar que deixo mais algumas referências.

Caso tenha interesse de ler sobre o funcionamento do uMelt. Aqui o link para download da publicação/paper original do grupo.

https://academic.oup.com/bioinformatics/article-lookup/doi/10.1093/bioinformatics/btr065